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Enzyme Link Inmuno Solvent Assay (ELISA)

Utiliza un anticuerpo unido a un enzima. También necesitamos separar la fracción unida de la libre. Utilizamos mayoritariamente un soporte sólido de plástico. Se utilizan placas de 96 pocillos para testar varias cosas a la vez y abaratar costes. Fue descrita en el año 1961. Existen varios tipo de ELISA, de los cuales veremos cuatro.

ELISA directo.

En un soporte sólido de plástico, pegamos en el fondo el antígeno que queremos analizar. Se bloquean los huecos con proteína (Albúmina bovina normalmente). Añadimos anticuerpo que reconoce el antígeno, ya marcado con un enzima. Incubamos un tiempo y realizamos lavados para quitar todo el anticuerpo que no se ha pegado. La fracción libre se tira. La cantidad de anticuerpo con enzima que tengamos es proporcional a la cantidad de antígeno. Añadimos un sustrato que en presencia del enzima marcador, pasa a tomar un color específico (Sustancia cromógena). Por ejemplo, la peroxidasa utiliza aminobendicina, que en presencia de agua oxigenada pasa a agua y oxígeno, que oxida al DAB, produciendo un color marrón. Ese color lo podemos leer en un espectrofotómetro con los filtros adecuados.

ELISA indirecto.

En este caso el primer anticuerpo no está unido con el enzima de marcaje, sinó que necesitamos un anticuerpo secundario marcado que reconozca al primero. Pasos:

Pegar el antígeno.

Bloquear con proteína.

Añadimos el suero del enfermo (Si hay anticuerpos frente al antígeno, se pegan).

Lavamos Separamos fracciones Tiramos la libre.

Añadimos el anticuerpo secundario marcado con un enzima. Suelen ser anticuerpos frente a inmunoglobulinas humanas,.

Incubamos.

Lavado para eliminar anticuerpos libres.

Añadimos el cromógeno, a mas color mas anticuerpo y mas antígeno.

Nos permite cuantificar, al comparar con un control. Tendremos de antemano una curva patrón específica para cada ensayo. Es necesario además establecer rangos de positivo y negativo.

ELISA competitivo.

Se trata en muchos aspectos a una técnica similar al RIA. Pegamos el antígeno al sustrato. Añadimos anticuerpo primario. Añadimos antígeno libre igual al que está pegado. Parte del anticuerpo se pega al antígeno pegado y otra al libre. Al lavar nos llevamos la fracción con anticuerpo pegado al antígeno libre. Añadimos el anticuerpo secundario marcado con enzima. El color aparece tras el revelado, y a mayor antígeno soluble en la muestra, menor color obtendremos.

Es mas sensible que el resto de los ELISA. También debemos realizar una curva patrón con cantidades conocidas de antígeno y anticuerpo.

sustrato de elisa

La verdad los tres ensayos son bastante largos así que te recomiendo que busques en un manual de laboratorio o un cuaderno de protocolos pero e doy el fundamento:

ELISA DIRECTA. Pegas tu muestra a la placa que contiene tu antígeno por ejemplo virus hepatitis en suero. Lavas y colocas tu conjugado (es un anticuerpo que reconoce tu antígeno -virus- de tu muestra y está unido a una enzima) incubas y lavas. despues colocas el sustrato para la enzima del conjugado. si da color es que el virus está presente.

ELISA INDIRECTA. Pegas un antígeno conocido por ejemplo OVA, incubas y lavas. Colocas tu suero problema (que podrá o no tener anticuerpos anti OVA), incubas y lavas. Se coloca el conjugado (es un anti-inmunoglobulina con una enzima, reconoce el primer anticuerpo), se incuba y lava. se agrega el sustrato. Un cambio de color indica que el suero tenía anticuerpos anti_OVA (proteina de huevo).

ELISA SANDWICH. Se coloca un anticuerpo contra tu antíegno p. ejem Ag prostático (este primer anticuerpo se le llma de captura), se incuba y lava. Se coloca el suero problema. se incuba y lava. Se coloca el conjugado (un segundo anticuerpo con una enzima, es de la misma especificidad que el de captura), se incuba y se lava. se agrega el sustrato. un cambio de coloración indica presencia o aumento de antígeno prostático (es mas sensible que la INDIRECTA)